大鼠阴道上皮细胞体外培养

 1 培养方法 
  1.1组织块培养法 
  组织块培养法是大鼠阴道上皮细胞的传统培养方法,其基本过程包括麻醉、解剖、培养材料的准备、接种、置培养箱中培养等步骤,李雅钗等用组织块法原代培养大鼠阴道上皮细胞,结果显示组织块法操作简单,技术容易掌握,成功率高,但细胞爬出慢,效率低,原代培养周期时间长,一般需要数周时间,由于未分离上皮层与固有层,在上皮细胞生长的同时,常伴有成纤维细胞的混杂生长,且其传代培养成功率低,故在大鼠阴道上皮细胞的原代培养中应用逐渐减少。 
  1.2酶消化法 
  酶消化法的基本过程包括麻醉、解剖、取材、酶消化、中和、清洗、重悬、加入培养基、置培养箱中培养等步骤,虽然存在较难掌握酶消化时間、对细胞损伤大、操作繁琐、费用高等缺点,但由于其培养周期较短,而且可针对上皮细胞选择相应特异性酶,短时间内获取大量纯度高的细胞,减少成纤维细胞的混杂,逐渐被广泛应用于上皮细胞的原代培养。
 酶消化法最常用的消化酶有胶原酶,胰酶和中性蛋白酶(Dispase),这些酶既有单独使用,又有联合使用:①胶原酶:培养阴道上皮细胞常用的胶原酶包括Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶。胶原酶的消化作用针对性较强,Ⅰ型型胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大,可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损。故胶原酶应与其他酶联合消化细胞,不宜单独使用。②胰酶:胰酶可分解细胞膜表面蛋白质,增加细胞通透性,而且细胞粘附相关的蛋白质也可能被消化,从而达到分离效果,获得单个细胞或细胞团。但若消化时间过长容易造成细胞损伤。对此,刘方方[5]将胰酶消化方法改进为3步消化法,加0.25%胰酶,37 ℃消化10 min,吸管吹打,吸出的悬液用含10% FBS的DMEM/F12 终止消化,剩余组织再加0.25%胰酶消化,重复3次。结果该法获得的细胞数高于一步消化法(直接消化20~30 min),但无显著性差异。在首次换液时贴壁细胞数三步法高于一步法,有显著性差异,结果提示减少酶对细胞的消化作用时间,可以保持细胞的完整性和活性。因此,采用胰酶短时间多次消化终止的方法,可以避免胰酶对细胞的过度消化,从而降低对细胞的损伤。③中性蛋白酶:中性蛋白酶(Dispase)是从多粘芽孢杆菌中提取的金属蛋白酶,可被EDTA、EGTA、Hg和其他重金属抑制,属于氨基酸肽链内切酶。该酶被证实能快速且温和地来获得正常的二倍体细胞和细胞系。李亚楠[4]用Dispase酶和胰酶分步消化大鼠阴道上皮,用KBM配制的 DispaseⅡ消化后48 h贴壁细胞多于用 PBS 配制的DispaseⅡ;1.2 U/ml DispaseⅡ的分离结果评分及可获活细胞数高于 0.6 U/ml DispaseⅡ。另外,该酶能够选择性分解基底膜的纤维连接素和Ⅳ型胶原,破坏半桥粒结构。对桥粒结构作用很少,故Dispase作用于上皮层和固有层连接部位,完整地分離出上皮层而不分解单个细胞,更好地保留基底细胞层和上皮细胞的完整性和活性,与胰酶联合使用可获取更多的增殖细胞,且冷消化法(4 ℃)效果优于其他消化法,同时也解决了成纤维细胞污染的问题。 
  2 培养基 
  目前研究报道常用的上皮细胞培养基包括1640、DMEM、DMEM/F12、K-SFM、DK-SFM、EPLIFE和KGM[6-10],国外阴道上皮细胞培养使用最多的培养基为K-SFM,国内多使用DK-SFM和KGM,均可成功培养出大鼠阴道上皮细胞。 在含血清的培养基中,成纤维细胞生长优势大于上皮细胞,导致细胞纯度不够,且血清有促进细胞分化的作用,使上皮细胞易于老化,角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)不含有血清,能有效地减少混杂在上皮细胞中的纤维细胞生长,适合各种角化上皮细胞的培养,并可根据需要添加不同成份:如抗生素、胰岛素和表皮生长因子等[8];此外,当钙离子浓度升至1.0 mmol/L时,上皮细胞容易发生分化。研究发现,细胞外低浓度钙促进角质形成细胞增生;高浓度钙促进角质形成细胞分化、细胞间黏附[11]。K-SFM具有合适的低钙离子浓度(0.05~0.15 mmol/L),可保持上皮细胞不分化而处于增殖状态[9]。但近年国内不允许进口K-SFM,以改良型角质形成细胞无血清培养基(DK-SFM)为其替代培养基,DK-SFM除了supplement和K-SFM不一样以外,其他成分都与K-SFM一样,但由于该培养基的 supplement成分中的牛脑垂体提取物(bovine pituitary extract,BPE)是人工合成的确定成分,而非天然成分,可能会影响培养效果。KGM为角质化细胞生长专用培养基,是无血清培养基,基础培养基中不含生长因子和补充营养物,需配套添加角质化细胞生长因子群(Keratinocyte growth factors),其含有牛垂体提取液、胰岛素、表皮生长因子、氢化可的松、肾上腺素、转铁蛋白、庆大霉素和两性霉素B等[10]。EPLIFE本身含有牛垂体提取液、胰岛素、表皮生长因子,氯化钙为独立包装,可根据不同细胞培养需要自行添加,大量应用于角质细胞的培养,有研究将其应用于小鼠阴道上皮细胞培养且效果良好,是否可以EPLIFE替代K-SFM用于大鼠阴道上皮细胞培养还需进一步研究。 
  3 动情周期 
  阴道黏膜为复层鳞状上皮,且受到内分泌系统的影响而呈周期性改变。不同时期的阴道分泌物涂片的特点不同:动情前期大多数为椭圆形的有核上皮细胞,偶见少量角化细胞。动情期绝大多数为外形不规则的角化上皮细胞,呈“落叶状”堆积或相互连接成片,间有少量有核上皮细胞。动情后期不规则角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞均可见,且比例相当。动情间期为大量白细胞及少量有核上皮细胞粘液。有研究发现根据阴道涂片取动情前期,动情期,动情后期,动情间期大鼠阴道组织块分离及培养。发现动情前期,动情期的组织块上皮层较动情后期及动情间期厚,且动情前期和动情期的组织块较动情后期及间期获得更多的上皮细胞。但动情期分离出的多边形角化细胞较多,细胞活性降低,故在动情前期取阴道上皮可分离更多上皮层,能获得较多的活细胞[4-5]。因研究报道少,尚不能得出确切结论。 
  4 包被 
  阴道上皮细胞体外培养均存在上皮层获得有限、细胞贴壁不佳甚至不贴壁等问题,因此,李亚楠[4]尝试用纤连蛋白/Ⅰ型胶原(FN/C)及去离子水包被培养瓶后培养大鼠阴道上皮细胞,结果发现FN/C 包被液处理的培养瓶相比去离子水可以获得更多的贴壁细胞。因而认为,在原代培养大鼠阴道上皮细胞时用FN/C等包被的培养瓶可以获得更多的贴壁细胞。纤连蛋白是细胞外基质一种高分子量糖蛋白(约440 kDa),它结合跨膜受体蛋白整合素,可以结合细胞外基质成分如胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等,它的肽链分成细胞粘附区和胶原粘附区,它能促进细胞在塑料培养表面的附着,同时也能促进细胞粘附到胶原上,故纤连蛋白在细胞粘附、生长、迁移和分化中起着非常重要的作用。
 综上所述,现有体外培养大鼠阴道上皮细胞方法各有优缺点,组织块培养法为经典且基础的培养法,其操作简单,成功率高,且成本较低,但培养周期长;酶消化法培养周期短,可在短时间内获得大量纯度较高的细胞用于实验研究,优于组织法,使用较为广泛,但除了胰酶、胶原酶和中性蛋白酶应用比较成熟外,其它酶类很少深入研讨。培养基成分尚待进一步完善,以模拟细胞体内生长环境,为更深层次的研究提供基础。对于动情周期的选取与阴道上皮细胞培养的关系目前研究极少,仍需进一步研究探讨其意义。培养瓶包被技术的应用一定程度上解决了细胞贴壁困难的问题。 
  参考文献: 
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  [10]Li Y,Liu F,Zhang Z,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells could acquire the phenotypes of epithelial cells and accelerate vaginal reconstruction combined with small intestinal submucosa[J].Cell Biology International,2015,39(11):1225-1233. 
  [11]Bikle D D,Xie Z,Tu C L.Calcium regulation of keratinocyte differentiation[J].Expert Review of Endocrinology& Metabolism,2012,7(4):461-472.编辑/成森
浏览次数:  更新时间:2017-09-30 09:24:03
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